小白是一个实验新手,很多时候提质粒提出来的浓度都有很大差异,有的高达500~600ng/uL,有的却只有几十。用的都是相同的菌株和试剂盒,为什么小提浓度会有这么大的差别呢?

要解决小白问题,我们得先来了解下质粒。

拷贝数

对于质粒载体,拷贝数是我们最关心的特性之一。实际上,每个细菌中的质粒的拷贝数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质,可以把质粒分为两类:

严紧型质粒:当细菌染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细菌内只含1~2个质粒;

松弛型质粒:当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细菌内一般含20个左右质粒拷贝。这些质粒的复制是在寄主的松弛控制之下的,每个细菌中含有10-200份拷贝,如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还可使质粒拷贝数增至几千份。

当然,恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、质粒的大小及培养条件有关。

那么到这里你可能会问,高拷贝质粒我们可以多提一点质粒,低拷贝数的质粒有什么作用呢?确实,低拷贝数的质粒用途不是十分广阔,主要用于以下两点:

  1. 高拷贝数的质粒往往不稳定,进行大片段克隆或者带有毒性DNA克隆时会用低拷贝;
  2. 质粒的扩增会占用大量资源,当载体用于表达或者其他用途时,也会使用上低拷贝质粒。

质粒的接合转移与穿梭质粒

质粒的接合转移:是细菌遗传物质转移的一个重要方式。在质粒转移过程中,供体菌和受体菌通过结合作用紧密接触,质粒从供体细胞向受体转移,同时进行质粒复制。按能否自主转移,可以将天然存在的质粒分为转移型质粒和非转移型质粒两大类。

这里要注意的是,获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性,如耐药性或产生细菌素的能力等。从环境友好出发,实验室里的废弃菌液,一定要灭过菌才能倒哦!

穿梭质粒:是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和筛选,因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间,也可以推广到真核生物表达载体的构建,如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增,也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。

质粒的不相容性

通俗来说,就是一山不能容二虎。但是作为科学来说,我们需要一个严谨的定义。

“利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向自细胞的分配过程中彼此竞争,这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处,这种现象称之为不相容性”。

那要怎么才能在一个菌里面使用两个质粒呢?简单的方法就是使用不同复制源的且带有不同抗性基因的两个质粒。

如何读懂一个质粒

如何读懂一个质粒,我们以一个例子说明:

 

  1. 首先看复制起点Ori: 了解质粒是原核质粒/真核质粒/穿梭质粒。
  2. 筛选标记:一般是抗某种抗生素基因,便于后期筛选,比如上图中抗性为Amp抗性。
  3. 多克隆酶切位点MCS:我们目的片段就是要插入这些多克隆酶切位点中间。
  4. 看是否含有表达系统原件即启动子-核糖体结合位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。

质粒图谱哪里去找?

方法一:使用 Vector NTI 软件

Invitrogen 公司的这款软件绝对是分子生物学虫子们的福音。这款软件的软件包里面会包括 Invitrogen 公司的所有质粒图谱信息和其他比较常见和经典的质粒图谱。要想对质粒图谱了解更直观,安装这款软件是非常必要的。

另外再给小伙伴们介绍两款基因序列分析编辑的软件:SnapGene和DnaStar,在我们的菜单“科研管家”里有介绍哦。

方法二:查找质粒图谱的网站

Addgene
地址:http://www.addgene.org/

Vector DB

网址:http://genome-www.stanford.edu ... .html
此网站页面比较简陋,但分类比较直观,总结和分类都比较完整。基本包括了所有表达系统的质粒信息。

NCBI

网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
这个名气太大就不介绍了。

Google 及 Google 学术

Google 确实是个好东西,学生物的应该好好的学习下它的用法。
检索式子:质粒名 + map
质粒名 +sequence +filetype:txt or filetype:pdf
或者:进入 google,点击「图片搜索」,直接查找图谱。

其他的一些核酸数据库
欧洲分子生物学实验 EMBL:http://www.ebi.ac.uk/

方法三:如何查找经过改造过的质粒的质粒图谱

有些质粒是经过改造的,所以通过上述方法不能查询到相应信息。这时,可以在 google scholar 中输入质粒名称,可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒,从而可了解到质粒的来源或者籍此向作者咨询或索取。