流式细胞术是非常让人着迷的实验。在众多医学研究手段里,如果说弱水三千只取一瓢的话,那我会首选流式细胞术。从我个人感受来讲,流式细胞术高速客观,具有统计学意义,能够处理复杂样本并同时获取多种参数,最最关键的是它性能可靠,可重复性非常好。

虽然也存在一些局限,但流式细胞术比起传统的细胞生物学研究手段来讲完全可以获得「独孤求败」的桂冠了;如果算上共聚焦和膜片钳,当真可以算拉动现代细胞生物学的「三驾马车了。

虽然介绍流式细胞术的入门文章很多,很多同学也对流式细胞术耳濡目染已久,看师兄师姐做过无数,可真到自己做的时候却又总出问题。据毛老师多年观察,很多同学在实验设计的时候就埋下了隐患,最常见的问题就是对照设置不合理,最后导致整体实验失败或数据不理想。因此,今天我们来谈谈成功的流式细胞实验设计都需要设置哪些对照。

毫不夸张地说,设置合理的对照组是整个实验成功的关键;反过来说,如果你掌握了流式实验如何设置对照的精髓,对整个免疫学相关的实验设计都会有极大地帮助。

流式对照至少有 5 种:生物学对照,空白对照,同型对照(Isotype control),补偿对照(也叫单阳性对照)和 FMO 对照,主要目的是为了避免出现的假阳性或假阴性结果。下面我们以一个具体的凋亡实验来看看如何设置对照组。下图是 Annexin V/PI 检测凋亡的原理示意图。

比如有两组细胞,一组给予药物处理(Treat 组),一组给予 DMSO 溶剂(Vehicle 组),拟用 Annexin V/PI 检测凋亡,我们来看看都需要设置哪些对照。

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生物学对照

这个很容易理解,也是很多同学最早设立的对照。这里 Vehicle 组就是生物学对照组。可能很多同学想象力就局限于此了,有了生物学对照就够了呗,还需要额外对照吗?答案是肯定的,别忘了流式细胞术也是一种免疫学实验,下面我们继续来设置对照。

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空白对照

在流式上机检测前,我们还需准备额外一组细胞(正常或处理过的皆可),什么染料也不加,作为空白对照。为什么要设置空白对照呢?除了阳性荧光信号之外,我们还需要排除样本是否自带荧光背景,所以要用空白对照来验证在各个检测通道上的信号是否都是阴性。

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同型对照(Isotype control)

这个对照很多同学都比较陌生。这个还得从抗体结构说起。大家知道抗体是个 Y 字形的,Fab 区域是特异性识别抗原的。在做蛋白免疫印迹时,只需考虑 Fab 的特异性就可以了,但是细胞的话稍微有点不同,因为有些细胞,特别是免疫细胞(B 细胞,T 细胞,巨噬细胞等等),它们表面有 Fc 受体,所以这个同型对照是为了评估抗体 Fc 段与靶细胞的结合情况。如果还不懂的话请看下图。

所以在做免疫细胞的流式检测时,我们通常都需要加入 Fc 受体封闭剂,之后再加入目标抗体的 isotype 作为同型对照,来排除细胞 Fc 受体造成的假阳性结果。一般试剂商都会告知该抗体需要使用哪种同型抗体。

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补偿对照(单阳性对照)

要理解这个对照,首先需要知道什么是荧光补偿。一图胜前言,下面这个示意图说得比较明白。

简单来说,需要使用几种颜色的抗体,就需要设置几种颜色的单阳性对照。这个对照可以用细胞来做,也可以特殊的微球的来做。这里严重推荐使用补偿微球来作为补偿对照,一是能节约时间和样本,二是,有时候自己做的单阳性对照效果不佳,阳性信号不强,就失去了补偿对照的意义了。下图是我用补偿微球的效果。

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荧光减一(FMO,Fluorescence minus one)对照

如果只用到两种颜色的话,这个对照可以用单阳性对照代替,如果三种以上颜色的话,就需要再设置 FMO 对照来评估其他荧光染料的干扰和补偿本底,帮助正确设置阳性门。

下图演示如果按空白对照组设定界线之后得到的细胞比例比 FMO 设定的值要大。从这个图可以看出,空白对照仅仅是设定阴性界线,但非阴性并不等于就是阳性,所以还需 FMO 来设定阳性界线。再打个比方,比如人体体温正常是 37°,小于 37° 肯定不是发热,那超过 37° 就一定是发热吗,比如 37.1°?(发热的诊断界线是 37.3°)。

所以,综上所述,如果只检测两种颜色的话,至少需要 5 个对照(生物学对照 + 空白对照 + 同型对照 + 2 个单阳性对照)。如果要检测 3 种颜色的话,我们来算算,生物学对照 + 空白对照 + 同型对照(可以不同的 isotype 做在同一管里)+3 个单阳性对照 + 3 个 FMO 对照,一共需要 9 个对照。

只有设置了合理的对照,才能得到准确可靠的结果,小伙伴们 get 到了吗?下次再去做流式,就不会被流式的老师怼得无地自容了吧。如果觉得对您有所启发,请点个赞哦,要是感兴趣的同学比较多,我们下次再继续谈谈样本处理和颜色搭配的问题。

最后想提一点冷知识,流式细胞术(Flowcytometry)是近年来流行起来的叫法,但它和 FACS 严格来说不是同一个意思,FACS 意思是 Fluorescence activated Cell Sorting,以前老一辈们都叫荧光激发细胞分选实验,S 是分选的意思,但实际上很多流式细胞仪还只能做到检测分析,不能实现分选,我们只是习惯用 FACS 来指代流式细胞检测术而已。

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